Молекулярные механизмы холодоадаптации и реверсий к ts+ фенотипу вирусов гриппа а и в
Скачать 343 Kb.
|
На правах рукописи ЦФАСМАН Татьяна Михайловна МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ХОЛОДОАДАПТАЦИИ И РЕВЕРСИЙ К TS+ ФЕНОТИПУ ВИРУСОВ ГРИППА А И В 03.02.02 – вирусология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2010 Работа выполнена в НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН Научный руководитель:
^
^ НИИ гриппа СЗО РАМН Защита диссертации состоится «23» сентября 2010 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 в НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5а С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН Автореферат разослан «___» ___________ 2010 г.
^ Актуальность проблемы. Живые гриппозные вакцины создают на основе холодоадаптированных (ХА) штаммов вируса гриппа. Основными фенотипическими маркёрами, которые характеризуют аттенуацию ХА штаммов (в конечном итоге, их апатогенность для людей), являются са и ts фенотип, т.е. способность к эффективной репродукции при пониженной (260С) и неспособность к репродукции при повышенной (39-400С) температуре. Считается, что са, ts и аттенуированный (att) фенотип ХА штаммов стабилен благодаря совокупности мутаций, приобретённых этими штаммами в процессе адаптации к пониженной температуре, в генах PB2, PB1, PA, NP, M1/M2 и NS1/NS2 [Александрова Г.И. и Климов А.И., 1994; Ambrose C.S. et al., 2008]. Несмотря на то, что живые гриппозные вакцины на основе ХА штаммов в течение многих лет используются в России и в США, механизмы адаптации вирусов гриппа к пониженной температуре до сих пор изучены недостаточно. Исследования показали, что популяция ХА штамма А/Ленинград/134/17/57, используемого для производства живой гриппозной вакцины в России, гетерогенна и состоит из вариантов с различным набором мутаций. Этот факт может затруднять изучение механизмов аттенуации данного штамма. Роль отдельных генов в аттенуации ХА штаммов исследована лишь для четырёх штаммов, которые используются для производства вакцины: А/ЭннАрбор/6/60, B/ЭннАрбор/1/66, А/Ленинград/134/17/57 и В/СССР/60/69 [Hoffmann E. et al., 2005; Jin H. et al., 2003; Jin H. et al., 2004; Kiseleva I. et al., 2004; Kiseleva I. et al., 2010]. Только для двух штаммов – А/Ленинград/134/17/57 и А/Ленинград/134/47/57, полученных на основе одного и того же родительского штамма – известно, какие именно мутации произошли в процессе адаптации этих штаммов к пониженной температуре (для остальных штаммов достоверно неизвестны соответствующие предковые дикие штаммы, с которыми можно было бы провести сравнение) [Медведева Т.Е. и др., 1991; Ghendon Y. et al., 1984; Herlocher M.L. et al., 1993; Klimov A. et al., 1992]. До сих пор остаётся неясным, есть ли какие-либо закономерности, касающиеся появления мутаций в определённых участках генома ХА штаммов вируса гриппа. Неизвестно, существуют ли определённые локусы, в которых возникают мутации при адаптации вирусов гриппа к пониженной температуре или сходный фенотип ХА штаммов может быть обусловлен различным сочетанием мутаций в разных генах. Проблема различия темпов накопления мутаций вирусами гриппа А и В в процессе адаптации к пониженной температуре и обратной адаптации ХА штаммов к повышенной температуре требует дальнейшего изучения. Несмотря на подтверждённую стабильность фенотипа ХА штаммов вируса гриппа in vivo, неясно, при каких условиях возможна реверсия фенотипа подобных штаммов и достижимы ли эти условия во время репликации вируса в организме человека. Получить ответ на эти вопросы чрезвычайно важно прежде всего с точки зрения безопасности применения живой гриппозной вакцины. ^ Целью работы было изучение молекулярных механизмов холодоадаптации ХА штаммов вируса гриппа А и В и изучение проблемы стабильности фенотипа ХА штаммов на модели ts+ ревертантов ХА штаммов вируса гриппа А и В. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
^ Изучение фенотипа новых ХА штаммов и мутаций в их геноме вносит существенный вклад в понимание механизмов аттенуации вируса гриппа. Впервые показана возможность получения ts+ ревертантов ХА штаммов вируса гриппа в лабораторных условиях и показана роль как истинных реверсий, так и супрессорных мутаций в реверсии к ts+ фенотипу ХА штаммов вируса гриппа. ^ Полученные и охарактеризованные в работе ХА штаммы А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/63/87 могут быть использованы в дальнейшем для получения живой гриппозной вакцины. Показано, что для эффективного контроля генетической стабильности и безопасности ХА штаммов-доноров аттенуации вируса гриппа целесообразно комбинированное применение нескольких методов исследования, например, ПЦР-рестрикционного метода и комплементационно-рекомбинационного метода. ^
^ Материалы диссертации доложены на 13th International Conference on Negative Strand Viruses (Salamanca, Spain, 2006), XIII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных “Ломоносов-2006” (Москва, 2006), Third European Congress of Virology (Nuernberg, Germany, 2007), 18th Annual Meeting of the Society for Virology (Heidelberg, Germany, 2008), 14th International Congress of Virology (Istanbul, Turkey, 2008), конференции молодых ученых, посвященной 100-летию получения И.И. Мечниковым Нобелевской премии (Москва, 2008), 19th Annual Meeting of the Society for Virology (Leipzig, Germany, 2009), конференции молодых учёных НИИ ВС им. И.И. Мечникова РАМН (Москва, 2009), международной научной конференции “Противогриппозные вакцины нового поколения” (Санкт-Петербург, 2009). Апробация диссертации состоялась 22 апреля 2010 г. на научной конференции отдела вирусологии НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ. Получен один патент РФ. ^ Материалы диссертации изложены на 147 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований с обсуждением полученных данных, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 27 таблицами и 7 рисунками. Библиография включает 147 отечественных и зарубежных источников. ^ заключается в непосредственном участии в выполнении всех разделов данного исследования, а также в проведении анализа полученных данных. Автор признателен к.б.н. И.И. Акоповой за помощь в получении и анализе ts и ca фенотипа ХА штаммов А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/63/87, а также за предоставление данных комплементационно-рекомбинационного анализа ts+ ревертанта А/Ленинград/134/47/57/Rev и Е.Б. Файзулоеву за помощь в секвенировании штаммов А/Краснодар/101/59, А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/41/87. ^ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Вирусы, культуры клеток, куриные эмбрионы. В работе использовали ХА штамм-донор аттенуации для живых гриппозных реассортантных вакцин А/Ленинград/134/47/57 (Н2N2); эпидемические штаммы А/Ленинград/134/57 (H2N2), А/Гонконг/68 (H3N2), А/Краснодар/101/59 (H2N2), В/Виктория/2/87; ts мутанты штамма Вейбридж ВЧП (вируса чумы птиц (H7N7)) и ts мутанты штамма Росток ВЧП. ts мутанты штамма Росток были получены из Национального Института Медицинских Исследований (Лондон, Великобритания). В работе использовали 9-11 дневные куриные эмбрионы (птицекомбинат “Птичное”), а также линию клеток MDCK, полученную из Института Пастера, Франция. Клетки MDCK культивировали по стандартной методике на среде Игла MEM (“ФГУП ПИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН”, Москва) с 5% фетальной сывороткой телят фирмы “HyClone” (США). Для комплементационно-рекомбинационного анализа использовали первичную культуру куриных фибробластов, приготовленную из 9-10-дневных куриных эмбрионов по стандартной методике [Белов Г.А., 2002]. Для определения инфекционного титра вирусов в ЭИД50 и накопления вирусов для последующих опытов куриные эмбрионы заражали по стандартной методике 10-кратными разведениями вируса в аллантоисную полость [Шубладзе А.К. и Гайдамович С.Я., 1954]. Наличие вируса в аллантоисной жидкости определяли по реакции гемагглютинации с 0,5% суспензией эритроцитов кур. Инфекционный титр вируса в ЭИД50/0,2 мл расcчитывали по методу Кербера. Для определения ts и ca фенотипа исследуемых штаммов проводили титрование одновременно при оптимальной, пониженной и повышенной температуре. Разницу в уровне репродукции вируса гриппа при разных температурах выражали величиной RCT (reproductive capacity at different temperatures), которая определяется как разница между инфекционным титром вируса при оптимальной температуре 340С и титром при исследуемой температуре, измеряемым в lgЭИД50/0,2 мл. Для получения ХА вариантов штаммов вируса гриппа А/Краснодар/101/59 и В/Виктория/2/87, пассажи при пониженной температуре инкубации велись параллельно в куриных эмбрионах и в культуре клеток MDCK. На куриных эмбрионах пассажи проводили в течение 3 суток для вируса гриппа А и в течение 4-6 суток для вируса гриппа В (по 4 суток при температурах 26-300С и 5-6 суток при температуре 250С). На культуре клеток MDCK пассажи проводили в течение 3-7 суток, в зависимости от инфекционной активности вируса. Штамм считали обладающим ts фенотипом в случае, если он был неспособен к репродукции при повышенной температуре (400C для вирусов гриппа А, 380C для вирусов гриппа B), и ca фенотипом в случае, если RCT26 ≤ 3 lgЭИД50/0,2 мл. Получение ts+ ревертантов ХА штаммов вируса гриппа А (А/Краснодар/101/35/59 и А/Ленинград/134/47/57) и штамма вируса гриппа В В/Виктория/2/41/87 проводилось путем пассажей ХА штаммов в куриных эмбрионах при повышенной температуре. Для следующего пассажа куриные эмбрионы заражали 10-кратными разведениями аллантоисной жидкости из предыдущего пассажа. Инкубация при соответствующей температуре проводилась в течение 48 ч для вируса гриппа А и 72 ч для вируса гриппа В. Схема получения ts+ ревертантов представлена в таблице 1. Таблица 1. Схема высокотемпературных пассажей для получения ts+ ревертантов штаммов вируса гриппа А и В.
| ||||||||||||||||||||||||||||
Добавить документ в свой блог или на сайт
Похожие:
 | Влияние этиологии возбудителя на характер течения эпидемии гриппа | | Организация работы оперативного штаба по координации мероприятий по предупреждению распространения гриппа птиц и в условиях ликвидации... |
| Организация работы оперативного штаба по координации мероприятий по предупреждению распространения гриппа птиц и в условиях ликвидации... | | «Механизмы и инструменты психологического воздействия на потребителей в рекламных кампаниях Media Markt» (2012) |
| Дж. Фодора и Н. Хомского утвердилось мнение о том, что работу каждого модуля, в котором предположительно действует сравнительно небольшое... | | Психология манипуляции: феномены, механизмы и защита.— М.: ЧеРо, Издательство мгу, 1997. — 344 с. Isbn 5-88711-038-4 |
 | Математическое моделирование кинетики и топологии распространения компьютерных вирусов в информационно-вычислительных сетях различной... | | Механизмы реализации основной образовательной программы начального общего образования |
| Программа предназначена для преподавателя, ведущего научно-исследовательский семинар, учебных ассистентов и студентов направления... | | Мониторинг системных ресурсов и выявление скрытых резервов Защита от вирусов и несанкционированного доступа Безопасное удаление ненужных... |